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杭州銘特生物科技有限公司

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X-gal溶液 (20mg/ml )

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產(chǎn)品品牌Biosharp

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供貨總量1000 瓶

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更新日期2021-06-24 09:18

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商品信息

基本參數(shù)

品牌:

Biosharp

所在地:

浙江 杭州市

起訂:

≥1 瓶

供貨總量:

1000 瓶

有效期至:

長期有效
詳細(xì)說明

IPTG/X-Gal即用型溶液 

產(chǎn)品簡介:

藍白斑篩選是重組子篩選的一種方法。現(xiàn)在使用的許多載體都帶有一個大腸桿菌的DNA的短區(qū)段,其中有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的調(diào)控序列和前146個氨基酸的編碼信息。在這個編碼區(qū)中插入了一個多克隆位點(MCS),它并不破壞閱讀框,但可使少數(shù)幾個氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影響功能,這種載體適用于可編碼β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主細(xì)胞。因此,宿主和質(zhì)粒編碼的片段雖都沒有酶活性,但它們同時存在時,可形成具有酶學(xué)活性的蛋白質(zhì)。這樣,lacZ基因在缺少近操縱基因區(qū)段的宿主細(xì)胞與帶有完整近操縱基因區(qū)段的質(zhì)粒之間實現(xiàn)了互補,稱為α-互補。由α-互補而產(chǎn)生的LacZ+細(xì)菌在誘導(dǎo)劑IPTG的作用下,在生色底物X-Gal存在時產(chǎn)生藍色菌落,因而易于識別。然而,當(dāng)外源DNA插入到質(zhì)粒的多克隆位點后,幾乎不可避免地導(dǎo)致無α-互補能力的氨基端片段,使得帶有重組質(zhì)粒的細(xì)菌形成白色菌落。這種重組子的篩選,又稱為藍白斑篩選。如用藍白斑篩選則經(jīng)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的鈣化菌平板37倒置培養(yǎng)12-16h后,含有插入片段重組質(zhì)粒的細(xì)菌形成白色菌落,而沒有插入片段的質(zhì)粒細(xì)菌形成藍色菌落。

配制方法:

50mg/ml IPTG  5 ml:取250 mg IPTG,溶于5 ml無菌水中,過濾除菌后-20貯存。

20mg/ml X-Gal  5 ml:取100 mg X-gal,溶于5 ml 二甲基甲酰胺(DMF),棕色瓶中-20貯存。此試劑無需滅菌。

實驗程序:

1、轉(zhuǎn)化平板的制備:

向鋪好的含有相應(yīng)抗生素的固體瓊脂平板表面加入16 μlIPTG(50 mg/ml)40 μlX-gal (20 mg/ml),使用無菌的彎頭玻璃棒將其均勻的涂開,盡量使溶解X-gal的二甲基甲酰胺揮發(fā)干凈。

2、轉(zhuǎn)化

1)取部分連接產(chǎn)物加到50-100 μl感受態(tài)細(xì)胞中(感受態(tài)細(xì)胞應(yīng)剛從-70冰箱取出放于冰浴上,待剛剛解凍時加入連接產(chǎn)物,連接產(chǎn)物的加入量不超過感受態(tài)細(xì)胞體積的十分之一),輕彈混勻,冰浴30分鐘。

2)將離心管置于精確42水浴90秒,取出管后立即置于冰浴中放置2-3分鐘,其間不

要搖動離心管。

3)向離心管中加入250-500 μl 37預(yù)熱的SOCLB(不含抗生素)培養(yǎng)基,150rpm37振蕩培養(yǎng)45分鐘。此步目的是使質(zhì)粒上相關(guān)的抗性標(biāo)記基因表達,使菌體復(fù)蘇。

4)將離心管中的菌液混勻,吸取100 μl加到含相應(yīng)抗生素的SOBLB固體瓊脂培養(yǎng)基上,用無菌的彎頭玻棒輕輕的將細(xì)胞均勻涂開。待平板表面干燥后,倒置平板,37培養(yǎng)12-16小時。

3、檢測

將得到的白色菌落接種1-5 ml LB培養(yǎng)基,37搖床振蕩培養(yǎng)過夜,保存菌種后提取質(zhì)粒,應(yīng)用PCR或酶切方法鑒定插入片段是否正確。

注意事項

為了您的安全和健康,請穿實驗服并戴一次性手套操作。

保存條件:

-20保存,一年有效。

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